Cas12b позволяет избежать случайных связей

CRISPR/Cas – технология, позволяющая редактировать геном – с каждым годом становится все популярнее среди исследователей. Чаще всего в качестве редактора используют белок Cas9. Он нацеливается на ДНК-мишень, и при контакте с ней разрезает в нужном месте. Однако Cas9 может разрушать не те мишени, на которые был запрограммирован. Его возможная альтернатива — белок Cas12b. Для распознавания мишени ему нужно всего лишь 5 комплементарных нуклеотидов, тогда как для Cas9 это число гораздо больше. О том, почему так получается и какие перспективы ждут белок Cas12b, рассказывают в своей новой работе, опубликованной журналом RNA biology, аспирантка Ишита Джайн из Центра наук о жизни Сколтеха и ее соавторы.

CRISPR/Cas – на редкость простой и экономичный способ редактирования любого генома. Он приобрел популярность с момента своего открытия и сегодня применяется практически во всех генетических исследованиях. Однако белки-редакторы Cas помимо большого числа своих достоинств, обладают еще и существенным недостатком: в том или ином количестве клеток редактирование затрагивает нецелевые участки и может привести к очень неблагоприятным последствиям. Многие ученые работают над усовершенствованием белка Cas9, который чаще всего используется для редактирования генома. Но некоторые исследователи пошли другим путем: ведь есть обширная группа других белков Cas, помимо уже известного Cas9. Например, белок Cas12, который уже использовали в некоторых исследованиях.

Когда были получены пространственные структуры белка Cas12b, оказалось, что для разрушения мишени ему достаточно точного соответствия (комплементарности) всего пяти нуклеотидов гидовой РНК с мишенью (протоспейсером). Чем короче участок мишени, точно комплементарный направляющей РНК (так называемый seed-участок), тем больше вероятность того, что Cas12b распознает не ту мишень, которая планировалась. Однако Cas12b очень точно попадает в «правильную» мишень. Как же так получается?

Чтобы определить положение нуклеотидов, необходимых для разрушения протоспейсера, была создана библиотека плазмид, содержащих слегка различающиеся протоспейсеры. Важно, что последовательность, необходимая для распознавания Cas12b, у всех протоспейсеров была одна и та же. Понятно, что чем лучше протоспейсер соответствует CRISPR/Cas12b, тем лучше он будет разрушаться и тем меньше будет численность плазмид, которые его содержат (их просто разрушит Cas12b). Количество каждого протоспейсера ученые определили по числу соответствующих ему прочтений, полученных секвенированием ДНК плазмид. Оказалось, что наибольшее значение для взаимодействия с РНК-гидом имеют позиции 1–3 и 5 в протоспейсере.

Несмотря на очень короткий seed-участок, Cas12b считается очень специфичным белком. Это, вероятно, обеспечивается двумя путями: благодаря 15 позиции мишени (именно эта позиция является критической. Если заменить в ней хотя бы один нуклеотид, Cas12b полностью перестает распознавать мишень) и дополнительных участков вне протоспейсера, с которыми Cas12b также взаимодействует специфично.

Как отмечают авторы публикации, несмотря на то что напрямую эффективность Cas9 и Cas12b не сравнивали, можно с уверенностью говорить о том, что Cas12b — вполне рабочая альтернатива Cas9, которая, несомненно, найдет широкое применение в редактировании геномов.

Cas12b позволяет избежать случайных связей: 1 комментарий

Обсуждение закрыто.